EcoRV

EvoRV'in DNA tanıma dizisi. Yeşil çizgi kesme yeirni gösteriyor.
DNA'yı kesen EcoRV. Protein gevşek şekilde DNA'ya bağlanır ve tanıma dizisini bulmak için taramaya başlar. Dizi bulununca EcoRV DNA'yı 50°'lik bir açı ile büker ve tanıma yerinden onu keser.
Çift iplikli DNA ile komplekslenmiş EcoRV'in kristal yapısı. Proteindeki alfa sarmallar kırmızı, beta yapraklar mavi, DNA pembe gösterilmiştir.
DNA substratı (kırmızı ve mavi) ile kompleksleşmiş bir EcoRV homodimerinin (yeşil) şematik yapısı. Yukarıdaki resimle aynı olan bu yapı, farklı bir açıdan ve renklendirmeyle gösterilmektedir.

EcoRV ("eko R beş" okunur) bazı Escherichia coli suşlarından elde edilen bir endonükleazdır. Alternatif adı Eco32I'dir.

Bu enzim, moleküler biyolojide yaygın kullanılan bir tip II restriksiyon enzimidir , DNA'yı kestiği yerdeki uçlar küttür. Enzim palindromik olan 5'-GAT|ATC-3' DNA dizisini tanır ve onu dikey çizgi ile gösterilen yerden keser. Meydana gelen uçlar küttür ve küt uçlu bir klonlama yerine bağlanabilir.

Yapı

Eco RV bir dimerdir, iki altbirim birlikte bir DNA bağlanma bölgesi oluşturular.[1] EcoRV, normalde kestiği diziyi içeren bir DNA molekülü ile beraber kristalleştirilmiştir. Bu kristal kullanılarak bu protein-DNA kompleksinin yapısı çözülmüştür.[2][3] Enzimin çekirdek kısmı beş tane beta yaprak, bunların iki yanında da alfa sarmallar bulunmaktadır. Bu çekirdek bölge diğer tip II restriksiyon endonükleazlarına benzer. N-ucunda bir ikilenme (dimerizasyon) bölgesi vardır, bu bölge kısa bir α-sarmal, iki antiparalel β yaprak ve bir uzun α-sarmaldan oluşur. Bu bölge sadece EcoRV ve PvuII'de görülür.[4]

Etki mekanizması

EcoRI gibi EcoRV de bir homodimer (ikili) oluşturduktan sonra DNA'ya bağlanır ve tanıma dizisini keser. Enzim önce DNA'da herhangi bir yere zayıf şekilde bağlanır, sonra DNA üzerinde rastgele yürür, spesifik tanıma dizisini bulana kadar.[4] Proteindeki rastgele bağlanma yeri ile kesme yeri farklıdır.[5] EcoRV kendi tanıma dizisi için yüksek bir spesifiteye sahiptir. Enzim DNA üzerinde kayarken önce tanıma dizisinin dıştaki iki bazını (GAxxTC) tanır ve DNA'ya daha sıkı bağlanır, sonra eğer dizinin ortasındaki bazlar da doğruysa DNA eğrilir, proteinin bağlanması daha da sıkılaşır ve kesme meydana gelir.[6]

Enzimin dizisine bağlanması DNA'da şekilsel bir değişime yol açar, DNA 50° bükülür. Proteinin C-ucundaki pozitif yükler bu bükülmeyi sağlamaktadır.[7] DNA'nın bükülmesi bazların istiflenmesini bozar, küçük oluk açılır, büyük oluk sıkışır. Bu durum kesilecek fosfodiester bağını enzimin aktif bölgesine yaklaştırıp orada kesilmesini sağlar. Kesilme tanıma dizisi içinde gerçekleşir ve ATP gerektirmez.[4]

Enzimin aktif bölgesinde üç tane divalent metal iyonu bulunur. Bunlardan ikisi nükleofilik bir hidroksit iyonunu oluşturmaya yarar.[8][9]

EcoRV, protein etkisiyle DNA'da şekilsel bir değişiklik yapan tek tip II restriksiyon endonükleazları [4]

Kullanım

EcoRV çoğunlukla gen klonlaması sırasında bir plazmid vektörü kesip içine araştırma konusu olan bir geni yerleştirmek için kullanılır. Enzim pek çok imalatçı tarafından temin edilir, gerektiği biçimde çalışması için inek serum albümini ile birlikte kullanılır.

Genetik

EcoRV endonükleazının geni ve EcoRV ile aynı DNA dizisini tanıyan EcoRV metilazın genleri kromozomda birbirine bitişiktir, transkripsiyonları aynı bölgeden zıt yönlere doğru yapılır.[10]

Ayrıca bakınız

Kaynakça

  1. ↑ Stahl F, Wende W, Wenz C, Jeltsch A, Pingoud A (1998). "Intra- vs intersubunit communication in the homodimeric restriction enzyme EcoRV: Thr 37 and Lys 38 involved in indirect readout are only important for the catalytic activity of their own subunit". Biochemistry 37: 5682–8. DOI:10.1021/bi973025s. PMID 9548954.
  2. ↑ Winkler FK, Banner DW, Oefner C, et al. (May 1993). "The crystal structure of EcoRV endonuclease and of its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments". EMBO J. 12 (5): 1781–95. PMC 413397. PMID 8491171. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=413397.
  3. ↑ "EcoRV Endonuclease/DNA complex". Protein Data Bank. 5 Şubat 2012 tarihinde kaynağından arşivlendi. http://web.archive.org/web/20120205034442/http://www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=1AZ0. Erişim tarihi: 2011-01-04.
  4. 1 2 3 4 Pingoud A, Jeltsch A (2001). "Structure and functions of type II restriction endonucleases". Nucleic Acids Research 29 (18): 3705–3727. DOI:10.1093/nar/29.18.3705. PMC 55916. PMID 11557805. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=55916.
  5. ↑ Schulze C, Jeltsch A, Franke I, Urbanke C, Pingoud A (1998). "Crosslinking the EcoRV restriction endonuclease across the DNA-binding site reveals transient intermediates and conformational changes of the enzyme during DNA binding and catalytic turnover". EMBO J. 17 pages=6757–66. DOI:10.1093/emboj/17.22.6757. PMC 1171021. PMID 9822618. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1171021.
  6. ↑ Zahran M, Daidone I, Smith JC, Imhof P (2010). "Mechanism of DNA recognition by the restriction enzyme EcoRV". J. Mol. Biol. 401: 415–32. DOI:10.1016/j.jmb.2010.06.026. PMID 20600128.
  7. ↑ PMID 16981705
  8. ↑ Horton NC, Perona JJ (2004). "DNA cleavage by EcoRV endonuclease: two metal ions in three metal ion binding sites". Biochemistry 43: 6841–57. DOI:10.1021/bi0499056. PMID 15170321.
  9. ↑ Horton NC, Newberry KJ, Perona JJ (1998). "Metal ion-mediated substrate-assisted catalysis in type II restriction endonucleases". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 13489–94. PMC 24846. PMID 9811827. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=24846.
  10. ↑ Bougueleret L, Schwarzstein M, Tsugita A, Zabeau M (1984). "Characterization of the genes coding for the Eco RV restriction and modification system of Escherichia coli". Nucleic Acids Res. 12: 3659–76. PMC 318777. PMID 6328432. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=318777.
This article is issued from Vikipedi - version of the 1/11/2017. The text is available under the Creative Commons Attribution/Share Alike but additional terms may apply for the media files.