Protein saflaştırması
Protein saflaştırması, karmaşık bir karışımdan tek bir tip proteini izole etmek için izlenen bir seri süreçtir. İlgi duyulan bir proteinin işlevi, yapısı ve diğer proteinlerle etkileşiminin karakterizasyonu için protein saflaştırması şarttır. Başlangıç malzemesi genelde bir biyolojik doku veya mikrobiyal kültürdür. Saflaştırma sürecinin çeşitli adımları sonucunda, protein içinde hapsolduğu ortamdan kurtarılır, karışımda bulunan protein ve protein olmayan kısımlar birbirinden ayrılır, ve nihayet arzulanan protein tüm diğer proteinlerden ayrıştırılır. Bir proteinin diğer tüm proteinlerden ayrıştırmak, protein saflaştırmasının en zahmetli yanıdır. Ayrıştırma adımlarında proteinlerdeki büyüklük, fizikokimyasal özellikler, bağlanma afinitesi ve biyolojik etkinlik gibi unsurlardaki farklılıklardan yararlanılır.
Amaç
Saflaştırma preparatif veya analitik olabilir. Preparatif saflaştırmada, nispeten büyük miktarda saflaştırılmış protein üretimi amaçlanır. Bu tür proteinlerin örnekleri arasında enzimler (örneğin laktaz), gıdasal proteinler (örneğin soya protein izolatı) ve bazı biyofarmasötikler (örneğin insülin) sayılabilir. Analitik saflaştırmada ise, bir protein nispeten küçük miktarlarda, araştırma veya analiz amaçları için üretilir. Bu tür amaçlara örnek olarak, protein kimliklemek, nicelemek, ve onun yapısını, çevrim sonrası değişimleri ve fonksiyonları üzerinde araştırma yapmak sayılabilir. Üreaz ve pepsin enzimleri, kristalize edilebilecek derecede saflaştırılan ilk proteinler olmuştur.[1]
Stratejiler
Bir saflaştırma sürecinin tasarımındaki en temel seçim, başlangıç malzemesidir. Bir bitki veya hayvanın gövdesinde belli bir protein homojen şekilde dağılmış olmaz; proteinin konsantrasyonu farklı organ veya dokularda daha az veya daha çok olabilir. En yüksek konsantrasyona sahip doku veya organın kullanılması, saflaştırma işlemini daha verimli kılar, çünkü belli miktarda saf protein elde etmek için gereken hacim daha az olur. Eğer protein düşük miktarda mevcutsa veya ekonomik değeri yüksekse, bilim adamları rekombinant DNA teknolojisi kullanarak arzu edilen proteini yüksek miktarda üretecek hücreler geliştirebilirler (bu ekspresyon sistemi olarak adlandırılır). Rekombinant ekspresyon sayesinde protein, saflaştırılmasını kolaylaştıracak şekilde (örneğin Histidin etiketi ile) işaretlenebilir, böylece saflaştırma daha az sayıda adımla gerçekleşebilir. Ayrıca, rekombinant ekspresyonda arzu edilen proteinin oranı, doğal kaynaklardakine kıyasla daha yüksek miktarda olur.
Analitik saflaştırma genelde proteinlerin saflaştırılması için genelde üç özellikten yararlanır. Birincisi, proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılırlar, pH gradyanlı bir jel veya iyon değişim kolonu kullanılarak. İkincisi, proteinler boyları veya moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılırlar, boy dışlama kromatografisi veya SDS poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAJE) ile. Üçüncüsü, proteinler polarite veya hidrofobisitelerine göre ayrıştırılabilirler, ters faz kromatografisi ile.
Proteinler çoğu zaman iki boyutlu polikarilamit jel elektroforezi (2B-PAJE) ile saflaştırılıp sonra kütle spektrometresi ile peptit parmak izlemesi ile kimlikleri tespit edilir. Bu yöntem için protein miktarının nanogramlar mertebesinde olması yeterlidir.
Saflaştırma eldesinin belirlenmesi
Bir saflaştırma sürecini izlemekte kullanılan en genel yöntem, farklı adımların SDS-PAJE ile analizidir. Bu yöntem karışımdaki çeşitli proteinlerin miktarları hakkında ancak kaba bir fikir verir ve aynı moleküler kütleye sahip proteinlerin ayırt edilmesi mümkün olmaz.
Eğer proteinin ayırt edici bir spektroskopik niteliği veya enzim etkinliği varsa, bu özellikten yararlanılarak protein tespit edilebilir ve nicelenebilir. Böylece, ayrışımın fraksiyonları (farklı bölümleri) içinde saflaştırılan proteini bulunduranlar seçilebilir. Eğer proteini tanıyan antikorlar varsa, Western blot ve ELISA yöntemleri ile arzu edilen protein spesifik olarak tespit edilip nicelenebilir. Bazı proteinler reseptör işlevine sahiptir, saflaştırma adımları sırasında bir ligand bağlanma ölçümü kullanılarak bunların varlığı tespit edilebilir.
Çok adımlı bir saflaştırmayı değerlendirmek için, belli bir proteinin miktarı toplam protein miktarı ile kıyaslanmalıdır. Toplam protein tespiti için ışığın 280 nm dalga boyunda soğurulması ölçülür veya Bradford protein ölçümü kullanılır. Ancak, saflaştırmada kullanılan bazı reaktifler bu ölçümlere aykırı düşebilirler. Örneğin, imidazol (poli-histidin işaretli proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır) bir amino asit analogudur ve toplam protein ölçümünde kullanılan bisinşoininik asit ölçümüne etki eder. Düşük kaliteli imidazolda bulunan katışkılar da 280 nm'de soğurur, dolayısıyla morötesi absorbansına dayanan protein ölçümleri hatalı olur.
Protein saflığını belirlemekte kullanılan bir diğer yöntem, yüzey plazmon resonansıdır (YPR). YPR sayesinde proteinlerin bir yonga (silikon çip) yüzeyine bağlanması algılananabilir. Eğer arzu edilen protein bir antikora bağlı ise, yonga yüzeyine olan bağlanma oranı, söz konusu protein cinsinden ölçülebilir. Bu yolla proteinin toplam proteine oranı da belirlenebilir.
Protein saflaştırma yöntemleri
Proteinleri saflaştırmak için kullanılan yöntemler kabaca analitik ve preparatif yöntemler olarak ayrılabilir. İkisi arasındaki fark, kullanılan yöntemle ne kadar protein üretilebildiğine bağlıdır. Analitik yöntemlerde, bir karışım içindeki protein tespit edilip, miktarının belirlenmesi amaçlanır; preparatif yöntemlerde ise başka amaçlar için (yapısal biyoloji veya endüstriyel kullanım gibi) bir proteinin büyük miktarda üretilmesi amaçlanır. Genelde, preparatif yöntemler analitik amaçla da kullanılabilir ama bunun tersi doğru değildir.
Protein saflaştırması için çeşitli yöntemler mevcuttur ve genelde bunlardan birkaçının kombinezonu sonucu kullanılır. İlk defa saflaştırılacak bir protein durumunda bunlardan hangisinin uygulanacağı, kısmen deneme yanılma esasıyla belirlenir. Alternatif yöntemler arasında karar kılınırken göz önünde tutulan faktörlerden bazıları, harcanan zaman, malzemelerin masrafı ve elde edilen proteinin kalitesidir.
Ekstraksiyon (özütleme)
Bazı durumlarda bir doku veya hücrenin parçalanarak arzu edilen bir proteinin çözelti içine sokulması gerekir. Bu amaca ulaşmanın birkaç yolu vardır: tekrarlı dondurma ve eritme, sonikasyon, yüksek basınçla homojenizasyon, filtreleme, veya organik çözücülerle hücre zarının geçirgenleştirilmesi (permeabilizasonu). Seçilecek yöntem, proteinin ne derece hassas olduğu ve hücrelerin ne derece sağlam olduğuna bağlıdır. Bu özütleme sürecinden sonra çözünür proteinler çözelti içine girerler; hücre zarı, DNA ve diğer hücre bileşenlerinden santrifüjleme yoluyla ayrıştırılabilirler. Bu süreçte hücrenin proteazları da çözeltiye karışıp ve diğer proteinleri sindirmeye başlayabilirler. Eğer saflaştırılacak protein bu proteazlar tarafından parçalanmaya (proteoliz) duyarlı ise, bu işlemin hızla tamamlanması ve özütün soğuk tutulması tercih edilir, proteolizi yavaşlatmak için.
Çökeltme ve ayrımcı çözeltme
Toptan protein saflaştırmasında, yaygın olakrak kullanılan bir ilk adım, amonyum sülfat ( (NH4)2SO4 ) gibi yüksek çözünürlüklü bir tuz ile proteinlerin çökeltilmesidir. Bu işlemde, çözeltiye giderek artan miktarda amonyum sülfat eklenir ve farklı protein çökelek fraksiyonları toplanır. Bu yöntemin bir avantajı, çok büyük hacimler için dahi oldukça ucuz olmasıdır. Proteinleri ayrımcı olarak çökeltmek için butanol veya etanol gibi organik çözücüler de kullanılabilir.
Isıya dayanıklı bazı proteinlerin saflaştırılmasında kullanılan bir yöntem, ısıtma yoluyla diğer proteinleri denatüre etmektir. Denatüre olan proteinler çökelir, ısıya dayanıklı olan protein ise sıcaklık azaltıldıktan sonra tekrar katlanıp doğal konformasyonuna kavuşur. Çökelen proteinler çözeltide kalanlardan santrifüjleme yoluyla ayrılabilir.
Membran proteinlerinin saflaştırılması için hücre zarının parçalanması gerekir, böylece arzu edilen bir membran proteinin diğer membran proteinlerinden ayrılabilir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi bir deterjan hem hücredeki membranları çözmek hem de membran proteinlerini çözelti içinde tutmak için kullanılabilir. Ancak, eğer söz konusu proteinin saflaştırma sırasında üç boyutlu yapısını muhafaza etmesi arzu ediliyorsa, daha mülayim deterjanlar (Triton X-100 veya CHAPS gibi) kullanılır, çünkü SDS proteinlerde denatürasyona yol açar.
Hücrenin belli bir organelinde (mitokondri gibi) bulunan bir proteinin saflaştırılması durumunda, önce o organelin saflaştırılması, ardından o organeldeki proteinin saflaştırılmasına gitmek verimli bir yoldur.
Ultrasantrifüjleme
Santrifüjleme, merkezkaç kuvvet kullanarak, bir sıvı için süspansiyon halinde bulunan, farklı kütlede veya yoğunlukta taneciklerin birbirinden ayrışması için kullanılan bir işlemdir. Protein veya başka taneciklerden (örneğin bakteri hücreleri) oluşan bir karışım içeren bir kap (tipik olarak bir tüp veya şişe) yüksek hızda döndürüldüğünde, her parçacığın açısal momentumu, ona, kütlesi ile orantılı bir merkezkaç kuvvet verir. Belli bir taneciğe etki eden merkezkaç kuvvet, sıvının ona karşı uyguladığı direnç ile dengelenince tanecik sıvı içinde sabit hızda ilerler. Numunenin santrifüj içinde döndürülmesinin sonucunda, yoğun kütleli tanecikler dışarı doğru daha hızlı hareket ederler, düşük kütleli veya sıvı üzerinde daha çok sürtünme yapan taneciklere kıyasla. Taneciklerden oluşan bir süspansiyon "döndürülünce" (santrifüjlenince), kabın dibinde, "pellet" denen sıkışık bir çökelti topağı meydana gelir; sıvıda bulunan en kütleli ve en az sürüklenim gösteren tanecikler bu pellette diğer taneciklere kıyasla daha zenginleşmiş olurlar. Kabın dibinde sıkışmayan ve çoğunlukla sıvı içinde kalan taneciklere "süpernatan" (veya üst faz) denir; bu sıvı, kaptan boşaltmak yoluyla pelletten ayrılabilir. Santrifügasyon hızı numuneye uygulanan açısal ivme ile belirtilir, tipik olarak g 'nin katı olarak ifade edilir.
Eğer numuneler yeterince uzun süreli santrifüjlenirse, kabın içindeki çözeltinin yoğunluğu, dönme yarıçapı ile orantılı bir dağılıma ulaşır; bu sıvının içinde ilerleyen tanecikler kendileri ile aynı yoğunlukta olan noktaya kadar gidip (batıp veya yükselip) orada durular. Bu denge santrifüjlemesi ile belli yoğunlukta bir taneciğin yüksek derecede saflaşması elde edilebilir.
Sükroz gradyan santrifüjlemesinde bir santrifüj tübünün içine, konsantrasyonu lineer bir gradyan oluşturan bir sükroz çözeltisi konur, öyleki en yüksek konsantrasyon tübün altında, en düşük konsantrasyon tüpün üstündedir. Bu gradyanın tepsine bir protein çözeltisi yerleştirilir ve bir ultrasantrifüj içinde yüksek hızda döndürülür. Bu şartlar altında, yüksek kütleli makromoleküller tübün dibine doğru daha yüksek bir hızla ilerler, hafif molekÜllere kıyasla. Çözeltide sükroz olmayınca, tanecikler dönme merkezinden uzaklaştıkça daha çok merkezkaç kuvvete tâbi olurlar, bu yüzden ilerledikçe daha hızlı hareket ederler. Doğru tasarlanmış bir sükroz gradyanında dönme merkezinden uzaklaştıkça sıvının yoğunluğu artacağı için sürtünme artar, dolayısıyla taneciklerin ilerleme hızı zaman içinde yaklaşık sabit kalır. Bu sayede tanecikleri biribirinden ayırt etmeye yarayan faydalı ayrışma aralığı daha geniş olur. Bu gradyanlar içinde yapılan ayrıştırmaya "hız bölgesel" (İngilizcerate zonal) santrifügasyon denir. Protein veya tanecikler ayrıştıktan sonra gradyan, bölümlere (fraksiyonlara) ayrılır ve toplanır. Bu yöntemde bazen, saflaştırılacak olan proteinin büyüklüğüne bağlı olarak, sükroz yerine gliserol veya Percoll gibi silika tabanlı bir polimer de kullanılabilir (Percoll, GE Healthcare şirketinin tescilli markasıdır).
Dializ
Dializ, protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır. Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir. Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.
Kromatografik yöntemler
Genelde bir protein saflaştırma protokolünde bir veya daha çok kromatografik adım bulunur. Kromotografideki temel uygulama, proteini içeren bir çözeltinin, içinde özel bir malzeme (genelde "reçine" tabir edilir) bulunan bir kolon (cam veya metal bir boru) içinden geçirilmesidir. Çözelti kolon içinde ilerlerken farklı proteinler reçine ile farklı şekilde etkileşir ve bu nedenle kolonun içinden geçme süreleri farklı olur. Kolonun öbür ucundan çıkan proteinler zamana bağlı olarak farklı tüplerde toplanır, böylece arzu edilen protein karışımdaki diğer proteinlerin çoğundan ayrılmış olarak elde edilir. Bazı durumlarda proteinler kolon malzemesine sıkıca bağlanırlar, sonradan özel şartların uygulanması ile kolondan koparlar; kopmalarını sağlayan şartlar proteinden proteine fark eder. Proteinler kolondan çıkarken genelde 280 nm dalga boylu ışığı soğurmaları ile tespit edilirler. Çeşitli kromatografik yöntemler mevcuttur:
Boy dışlama kromatografisi
Boy dışlama kromatografisi proteinleri boylarına göre ayrıştırır. Boy dışlama kromatografisi olarak bilinen bu yöntemde kolon malzemesi poröz mikroskopik taneciklerden oluşur. Küçük moleküller poröz matriksin içine girebildikleri için, kolonun içinden geçen hareketli faza geri dönmeleri zaman alır; büyük moleküller ise matriksin içine giremediklerinden dolayı, hareketli fazın akıntısı ile hızla kolondan geçerler. Poröz matrikse giren moleküllerin matriksinin içinde geçidikleri süre büyüklükleri ile orantılıdır. Bu yüzden, belli bir büyüklük aralığındaki proteinlerin kolonun öbür tarafından çıkabilmeleri için gereken eluent (hareketli faz) hacmi, onların büyüklüğüne bağlı olur.
Protein saflaştırılmasında, kolondan çıkan eluent zamana bağlı olarak farklı deney tüplerinde toplanır. Saflaştırılacak proteinin bulunmadığı tüplerdeki malzeme atılır; kalan çözelti, arzulanan protein ve onunla aynı boydaki diğer proteinlerden oluşur.
İyon değişim kromatografisi
İyon değişim kromatografisi, bileşikleri iyonik yüklerinin cinsi ve miktarına göre olarak ayrıştırır. Kullanılacak kolon malzemesi (reçine), tipi ve elektrik yüklenme gücüne göre seçilir. Anyon değişim reçinelerinin artı yüklü olur ve negatif yüklü tanecikleri tutup ayrıştırmak için kullanılır; katyon değişim reçineleri ise negatif yüklüdür ve pozitif yüklü molekülleri ayrıştırmak için kullanılır.
Ayrıştırma başlamadan önce kolonun içinden bir tampon çözelti geçirilir, reçinenin karşıt yüklü iyonlarını dengelemek için. Numunenin kolona enjeksiyonu ardından, çözeltideki iyonlar ile diğer çözünenler (proteinler) arasında, reçineye bağlanmak için bir yarışma oluşur. Her bir çözünenin reçineye ne kadar sıklıkla bağlı kaldığı, onun taşıdığı elektrik yüküye ilişkilidir. En zayıf yüklü bileşikler kolondan ilk çıkar, onun ardından çıkanlar giderek artan yüklü bileşiklerdir. Ayrışma mekanizmasının doğası gereği, ayrışmaya etki eden faktörler, pH, tampon tipi, tampon konsantrasyonu ve sıcaklıktır.
İyon ayrışma kromatografisi protein saflaştırılmasından çok etkili bir araçtır ve hem analitik hem preparatif saflaştırmalarda yaygın olarak kullanılır.
Afinite kromatografisi
Afinite kromatografisi, moleküler biçime (konformasyona) bağlı olan bir ayrıştırma yöntemidir, genelde her protein için farklı bir kromatografi reçinesi kullanılır. Bu reçinelerin yüzeyinde ayrıştırılacak proteinlere özgül ligandlar bağlıdır. Antikor-antijen bağlanmasına benzer şekilde çalışan bu ligandlar, hedef proteine spesifik olarak bağlandığı için, kolona yüklelenen numunenin hemen tamamı ona tutunmadan akıp çıkar, kolona bağlı kalan sadece ligandın bağlandığı protein olur.
Çoğu membran proteini glikoproteindir ve lektin afinite kromatografisi ile saflaştırılabilir. Deterjanla çözündürülmüş proteinlerin, üzerinde lektin molekülleri bağlı olan bir reçine ile temas etmesi sağlanır. Lektine bağlanmayan proteinler kolon yıkanınca akıp giderler. Spesifik olarak bağlanmış glikoproteinlerin reçineden ayrışması için, proteindeki lektin bağlanma bölgesindeki lektinlerle yarışabilen bir şeker eklenir. Bazı lektinler glikoproteinlere o kadar sıkı bağlanır ki onlar şeker eklenerek ayrışamaz, bu tür glikoproteinlerin reçineden salınması için onların denatüre edilmesi gerekir.
Metal bağlanması
Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, 6 ila 8 histidinden oluşan bir peptidin, proteinin N- veya C-ucuna takılmasıdır. Polihistidin, nikel veya kobalt gibi, iki değerlikli (divalent) metal iyonlarına sıkı şekilde bağlanır. Numune, sabitlenmiş nikel iyonları bulunduran bir kolonun içinden geçirilir. Nikel, polihistidin etikete bağlanır. Etiketsiz proteinler kolona bağlanmadan geçerler. Etiketli proteinin kolondan çıkmasını sağlamak için imidazol kullanır (çünkü imidazol kolona bağlanmak için polihistidin ile yarışır) veya pH yaklaşık 4,5'e düşürür (çünkü düşük pH, etiketin metal iyonlarına olan afinitesini azaltır). Bu yöntem genelde genetik mühendislik yoluyla bir afinite etiketi (6xHis etiketi veya Clontech tarafından pazarlanan HAT etiketi) taşıyan rekombinant proteinleri saflaştırılmak için kullanılsa da, iki değerlikli katyonlara kendiliğinden afinitesi olan doğal proteinler için de kullanılabilir.
İmmünoafinite kromatografisi
İmmünoaffinite kromatografisi bir antikorun bir hedef proteine spesifik olarak bağlanmasından yararlanarak o proteinin saflaştırılmasıdır. Bu yöntemde antikor bir kolon malzemesi üzerinde sabitlenir, böylece kolon spesifik olarak bu proteine bağlanır, geri kalan her şey ise kolon içinden akıp geçer. Proteinin kolondan çıkması için pH veya çözeltinin tuzluluğu değiştirilir. Bir etiketin genetik mühendislik yoluyla proteinin yapısı ile bütünleştirilmesi gerekmediği için, bu yöntem doğal kökenli proteinlerin saflaştırılmasında kullanılabilir.[2]
Etiketli bir proteinin saflaştırılması
Bir proteine RuBPS gibi bir etiket takılması sayesinde normalde olmayan bir bağlanma afinitesine sahip olabilir. Genelde, karışım içindeki proteinler arasında bu afiniteye sahip olan tek rekombinant protein bu olduğundan, etiketin varlığı saflaştırmayı büyük oranda kolaylaştırır. En yaygın kullanılan etiket, Histidin etiketidir (His-tag), bunun nikel ve kobalt iyonlarına afinitesi vardır. Dolayısıyla, nikel veya kobalt iyonlar bir reçine üzerinde sabitlenerek, histidin etiketli proteinleri spesifik olarak bağlayan bir afinite yüzeyi elde edilmiş olur. Saflaştırılacak protein histidin etiketli tek protein olduğu için, karışımda bulunan diğer tüm proteinler kolona bağlanmadan içinden geçerler, ve geriye sadece reçineye bağlanmış olan histidin etiketli protein kalır. Bu proteinin daha sonra yıkama (elüsyon) denen bir işlemle kolondan çıkması sağlanır. Histidin etiketi kullanılması durumunda, elüsyon için imidazol kullanılır, çünkü bu bileşiğin halka yapısı histidininkine benzer ve nikel iyonlarına bağlanmak için histidin etiketleri ile yarışır. Arzu edilen protein, yıkama sıvısının ana bileşenidir, ikinci bir saflaştırma adımı (boy dışlama kromatografisi veya yüksek performanslı sıvı kromatografi gibi) kullanılması ile, istenmeyen diğer ikincil katışkılardan kolaylıkla arındırılabilir.
Bir proteini etiketlemenin bir diğer yolu, genetik mühendislik yoluyla proteinin içine bir antijen peptit dahil etmektir. Sonra, proteini içeren karışım ya bir kolondan geçirilir, ya da sabitlenmiş bir antikor ile kaplanmış gevşek reçine ile karıştırılıp bekletilir (inkübe edilir). Antikor sadece o antijen peptit ile spesifik bağlanma yaptığı için, kolon (veya reçine) yüzeyine bağlanan sadece arzu edilen protein olur. Bu işleme immünopresipitasyon (immüno-çökeltme) denir. Diğer proteinler çözeltide kaldığı için onlar reçineye bağlanmış etiketli proteinden kolaylıkla ayrılırlar. Antikora bağlı protein ise daha sonradan pH veya tuzluluk değişikliği ile reçine yüzeyinden akıtılabilir.
Etiketlere gerek kalmayınca bunlar bir proteaz aracılığıyla çıkarılabilir. Bunun olabilmesi için saflaştırılacak protein ile etiket arasına genetik mühendislik yoluyla önceden bir proteaz kesme dizisi eklenir.
Yüksek performanslı sıvı kromatografi
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya diğer adıyla yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, (İngilizce adının kısaltması olan HPLC olarak da bilinir) bir karışımdaki çözünenlerin bir kolon içinden daha hızlı geçmelerini sağlamak için yüksek basıncın uygulandığı bir kromatografi tipidir. Bu sayede difüzyon etkisi sınırlı olur ve çözünürlük daha iyi olur. En yaygın kullanılan şekli olan "ters faz" HPLC'de, kolon malzemesi hidrofobiktir. Proteinler kolona bağlandıktan sonra, giderek artan miktarda organik çözücü (asetonitril gibi) içeren bir gradyan kullanılarak akıtılırlar. Her bir protein, kendi hidrofibisitesi ile ilişkili olarak, gradyandaki çözücünün belli bir konsantrasyonunda kolon malzemesinden ayrışır. Saflaştırma işleminin ardından proteinler uçucu bileşikler içeren bir çözelti içinde yer alırlar, bu bileşikler liyofilizasyon yoluyla kolaylıkla giderilebilir.[3] HPLC saflaştırması genelde proteinlerin denatüre olmasına neden olur, bu yüzden kendiliklerinde tekrar katlanamayan proteinlerin saflaştırılmasında bu yöntem kullanılmaz.
Saflaştırılmış proteinin konsantrasyonu
Protein saflaştırmasının sonunda, protein genelde büyük bir hacim içinde bulunur ve konsantre edilmesi gerekir. Bunun için çeşitli yöntemler mevcuttur.
Liyofilizasyon
Eğer çözelti içinde proteinden başka çözünür bileşik bulunmuyorsa, protein liyofilize edilebilir (dondurulurak kurutulabilir). Bu çoğu zaman bir HPLC işleminden sonra yapılır. Böylece tüm uçucu bileşenler gider ve geriye proteinler kalır.
Membran filtrelemesi
Seçici geçirgen membranlar kullanılarak proteinler konsantre edilebilir. Su ve küçük moleküller membranın içinden geçer, protein ise geride kalır. Çözeltinin membranın içinden geçmeye zorlanması için mekanik bir pompa, gaz basıncı veya santrifügasyon kullanılabilir.
Analitik yöntemler
Elektroforez
Jel elektroforezi hem analitik hem preparatif amaçla kullanılabilen, yaygın bir laboratuvar tekniğidir. Elektroforez, bir elektrik alan içinde iyonları hareketidir.
Denatürasyonlu elektroforez
Çok yaygın kullanılan bir yöntem olan sodyum dodesil sülfat (SDS) poliakrilamit jel elektroforezinde, proteinler bir deterjan (SDS) ile denatüre edilirler. Bu şartlar altında proteinler katlanmış hallerini kaybeder ve negatif yüklü deterjan molekülleri ile kaplanırlar. Elektrik alanı içinde, bu deterjan kaplı proteinler boyları ile ters orantılı bir hızla hareket ederler, böylece büyüklüklerine göre ayrışırlar.
Bu yöntem analitik amaçla kullanıldığında, bir jel içinde ayrıştırılan proteinlerın yerleri, Kumasi boyası ve Gümüş boyaması ile tespit edilir. Preparatif yöntemlerde elektroforetik jelin içinden proteinin izole edilmesi gerekir. Proteinin bulunduğu jel bölgesi kesilip çıkarılabilir veya protein jelin ucundan dışarı akarken doğrudan toplanabilir.
Saflaştırma stratejisi bakımından değerlendirildiğinde, denatürasyonlu elektroforez yüksek ayrırım gücü sağlar (boy dışlama kromatografisine kıyasla) ama kromotografik kolon yöntemler kadar kolaylıkla yüksek miktarda protein saflaştırılmasına ölçeklenemez.
Denatürasyonsuz elektroforez
Proteinler SDS ile denatüre edilmeden de bir jel içinde elektroforez ile ayrıştırılabilirler. Ancak, SDS-PAJE'de olduğu gibi üzerlerindeki yük boyları ile orantılı olmaz, hareket hızları hem kütlelerinin, hem taşıdıkları elektrik yükünün hem de şekillerine bağlı olur.
İzoelektrik odaklama
İzoelektrik odaklamada, proteinlerin içinde hareket ettikleri jel bir pH gradyanına sahiptir. Numune jelin bir tarafına yerleştirilip elektrik akımı verilince, proteinler hareket etmeye başlar. Her protein, yüksüz olduğu pH'de hareketini durdurur. Böylece proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılabilirler. İzoelektrik odaklama, iki boyutlu jel elektroforezinin genelde birinci adımı olarak kullanılır. Bu teknik protein saflaştırmasında preparatif bir adım olarak da kullanılabilir.
Kaynakça
- ↑ "The Nobel Prize in Chemistry 1946". 27 Mayıs 2016 tarihinde kaynağından arşivlendi. http://web.archive.org/web/20160527070735/http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1946/. Erişim tarihi: 2011-09-19.
- ↑ Ehle H, Horn A (1990). "Immunoaffinity chromatography of enzymes". Bioseparation 1 (2): 97–110. PMID 1368167.
- ↑ Regnier FE (October 1983). "High-performance liquid chromatography of biopolymers". Science 222 (4621): 245–52. PMID 6353575. http://www.sciencemag.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=6353575.